Uji Protein dengan Kromatografi Lapis Tipis

Pengertian

Asam amino diperoleh dari hasil hidrolisis protein, baik menggunakan enzim maupun asam. Asam amino adalah senyawa organik yang memiliki gugus fungsional karboksil (COOH) dan amina (biasanya -NH2). Gugus karboksil memberikan sifat asam dan gugus amina memberikan sifat basa. Dalam bentuk larutan, asam amino bersifat amfoterik yaitu cenderung menjadi asam pada larutan basa dan menjadi basa pada larutan asam. Perilaku ini terjadi karena asam amino mampu menjadi zwitter-ion. Ada beberapa metode analisis asam amino, misalnya metode gravimetri, kalorimetri, mikrobiologi, kromatografi dan elektroforesis. Salah satu metode yang banyak memperoleh pengembangan ialah metode kromatografi. Macam-macam kromatografi ialah kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis dan kromatografi penukar ion. 

Kromatografi Lapis Tipis yaitu kromatografi yang menggunakan lempeng gelas atau alumunium yang dilapisi dengan lapisan tipis alumina, silika gel, atau bahan serbuk lainnya. Kromatografi lapis tipis pada umumnya dijadikan metode pilihan pertama pada pemisahan dengan kromatografi. Pemisahan asam amino dengan metode kromatografi ini didasari oleh kemampuan suatu jenis asam amino terlarut dalam suatu campuran larutan tertentu pada fase stasioner. Untuk memperoleh pemisahan asam amino yang baik dapat digunakan dua fase pelarut, misalnya pasangan fenol - air, n-Butanol - air, atau dengan tiga fase pelarut tersebut dimana setiap jenis asam amino mempunyai koefisien partisi, kertas digunakan sebagai pendukung air. Campuran komponen yang akan dipisahkan ditempatkan pada fasa stasioner (zat padat), kemudian dihubungkan dengan fase cair, maka fase cair akan melalui fase stasioner  sambil membawa komponen tersebut, dimana perbandingan kecepatan perpindahan komponen dengan kecepatan permukaan fasa mobile (cair) merupakan dasar untuk mengidentifikasikan komponen yang dipisahkan. Perbandingan kecepatan ini disingkat dengan Rf (Rate Of Front). Pelaksanaan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Nilai Rf menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fase diam sehingga nilai Rf sering juga disebut dengan faktor retensi. Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut. 

Rf =  Jarak noda dari tempat pentotolan : jarak yang ditempuh pelarut

Semakin besar nilai Rf dari sampel, maka semakin besar pula jarak bergeraknya senyawa tersebut pada plat KLT. Nilai Rf akan besar jika senyawa tersebut kurang polar dan berinteraksi dengan adsorbent polar dari plat KLT. Bila identifikasi nilai Rf memiliki nilai sama maka senyawa tersebut dapat dikatakan memiliki karakteristik yang sama, begitu juga sebaliknya.

Kelebihan penggunaan kromatografi lapis tipis dibandingkan dengan kromatografi kertas adalah karena dapat dihasilkannya pemisahan yang lebih sempurna, kepekaan yang lebih tinggi, dan dapat dilaksanakan dengan lebih cepat.Banyak pemisahan yang memakan waktu berjam-jam bila dikerjakan dengan kromatografi kertas, tetapi dapat dilaksanakan hanya beberapa menit saja bila dikerjakan dengan TLC. Kelebihan dari kromatografi lapis tipis yang lain ialah pemakaian pelarut dan cuplikan yang jumlahnya sedikit, kemungkinan penotolan cuplikan berganda (saling membandingkan langsung cuplikan praktis) dan tersedianya beberapa metode. 

Sedangkan untuk kekurangan dari kromatografi lapis tipis yaitu, membutuhkan ketekunan dan kesabaran yang ekstra untuk mendapatkan bercak/noda yang diharapkan, membutuhkan sistem trial and eror untuk menentukan sistem eluen yang cocok, dan memerlukan waktu yang cukup lama jika dilakukan secara tidak tekun. 


Prosedur Analisis

Membuat larutan eluen dengan menggunakan larutan n–butanol, asam asetat, dan air dengan perbandingan 2,5 : 0,6 : 2,6 v/v. Kemudian eluen dimasukkan ke dalam chamber, dikocok sebentar, kemudian ditutup dan ditunggu sampai jenuh ± 30 menit, elanjutnya pada plat KLT yang sebelumnya telah digunting sesuai ukuran chamber (3 x 7 cm), dikeringkan kemudian dibuat garis batas bawah dan batas atas ± 1 cm, dibuat  titik-titik  pada  garis  batas bawah yang merupakan tempat penotolan larutan asam amino glisin, tirosin, asparagin, dan sampel. Setelah itu, semua larutan asam amino  dan  larutan  asam  amino  sampel ditotolkan pada titik yang telah dibuat pada plat KLT dengan menggunakan pipa kapiler yang sebelumnya berada dalam aseton. Selanjutnya dikeringkan pada suhu kamar. Apabila eluen telah jenuh, Plat KLT dielusi ke dalam chamber dengan hati-hati agar garis batas bawah tidak tercelup ke dalam eluen. Elusi dihentikan jika eluen menempuh jarak yang telah ditentukan sebelumnya (garis batas atas). Kemudian mengeluarkan plat dari chamber dan mengeringkan. Selanjutnya kromatogram disemprot dengan larutan ninhidrin, kemudian dikeringkan dalam inkubator dengan suhu kurang lebih 60 C selama beberapa menit. Setelah kering memberi tanda pada noda yang timbul pada kromatogram dengan pensil. Langkah terakhir yaitu menentukan nilai Rf dari masing-masing noda pada kromatogram.

Berikut ini tabel nilai Rf dari asam amino: